تست MTT

توسعه داروهای جدید رابطه بسیار نزدیکی با کشت سلول دارد. در انواع مختلف ارزیابی‌های سلولی، مولکول‌های مختلف، ترکیبات طبیعی استخراج شده و یا مواد موثره ایزوله شده بایستی از نظر سمیت مورد بررسی قرار بگیرند. برای فهمیدن تاثیرگذاری یک ترکیب بر سلول‌ها بایستی بتوانیم تعداد سلول زنده موجود در کشت سلول را مشخص کنیم. راه‌های مختلفی برای مشخص کردن تعداد سلول‌های زنده وجود دارد مانند بررسی ورود 3 هیدروکسی تیامین به ژنوم (3H-thymidine incorporation)، شمارش سلول با تریپان بلو، ارزیابی با استفاده از رنگ سنجی و فلوسایتومتری.

اکثر روش‌های ارزیابی مستقیم، هزینه، زمان و یا ترکیبات خاصی نیاز دارند که تنها در موارد محدود قابل استفاده اند و در صورت نیاز به انجام تعداد بیشتر تست قابل استفاده نیستند.

یک روش ساده تر برای ارزیابی بقای سلولی، سنجش ترکیباتی است که نشان دهنده بقا و فعالیت سلولی هستند. یکی از ترکیباتی که امروزه به عنوان نشانه یا مارکر بقا مورد استفاده قرار میگیرد NADH یا NADPH است. همانطور که میدانید ترکیبات NADH و NADPH حاصل فعالیت متابولیکی هستند و نشانه خوبی برای مشخص کردن بقای یک سلول در محیط کشت هستند.

نکته مهم در اندازه گیری ترکیبات احیا کننده NADH و یا  NADPH  این است که میزان مطلق این ترکیبات در لحظه نشان دهنده دقیقی برای فعالیت متابولیکی سلول نیست به همین علت سنجش میزان این ترکیبات نمی تواند روش خوبی برای ارزیابی بقای سلول باشد. اما بررسی میزان ترن آور یا باز تولید این ترکیب میتواند نشانه دقیقی از فعالیت متابولیکی سلول به حساب بیاید. برای همین، ما باید ترکیباتی را به محیط کشت و سلول وارد کنیم که بتواند توسط ترکیبات احیا کننده مورد نظر احیا شود.

اگر وارد این مقاله شده اید پس حتما نام بعضی از نمک های تترازولیوم و یا رسازورین به گوش شما آشنا باشد. ترکیباتی مثل MTT، MTS، XTT و WST از جمله نمک های تترازولیوم هستند که در حضور آنزیم دهیدروژناز با مصرف NADH/ NADPH احیا میشوند.

نتیجه احیای این نمک ها ترکیباتی رنگی است که با یک رنگ سنجی ساده قابل بررسی هستند. همانطور که در نام این مقاله مشخص است، ما در این مقاله به صورت ویژه به روش MTT پرداخته و این روش را به دقت بررسی میکنیم اما در ادامه سعی بر این است که مختصری در مورد سایر رنگ های احیا شونده و معایب و مزایای آنها نسبت به MTT صحبت کنیم.

تست بقای سلولی به روش MTT:

تست MTT یکی از پرکاربردترین تست‌های یک آزمایشگاه سلولی است. این تست با سنجش فعالیت متابولیکی سلول به عنوان یک مشخصه برای زنده بودن سلول، میزان بقای سلول را در یک آزمایش سلولی مشخص می‌کند. به طور معمول از این تست برای بررسی proliferation  و یا cytotoxicity استفاده می‌کنند. تست MTT بر اساس روش رنگ سنجی یا Colorimetry  بوده و اساس آن تبدیل نمک تترازولیوم زرد رنگ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide or) یا همان معرف MTT، به کریستال‌های فرمازان بنفش رنگ در سلول‌های فعال است.

در واقع آنزیم‌های اکسیدوردوکتاز وابسته به  NADP و  NADPH موجود در سلول‌های فعال عمل احیای MTT به فرمازان را انجام می‌دهند.  کریستال‌های فرمازان نامحلول هستند و سنجش میزان فرمازان تولید شده در شرایط نامحلول امکان پذیر نیست. در این مرحله بایستی این کریستال‌ها توسط یک ماده حلال مانند DMSO حل شوند تا رنگ ایجاد شده توسط دستگاه اسپکتروفوتومتر قابل خوانش باشد. با توجه به اینکه این تست مستعد خطا است، عموما تست MTT در پلیت‌های چندخانه و با تکرار زیاد انجام می‌شود و عمل خوانش در جذب 500-600 نانومتر توسط دستگاه پلیت ریدر یا الایزا ریدر خوانده خواهد شد.

هرچه محلول تیره تر باشد، نشان دهنده بیشتر بودن تعداد سلول‌های فعال در آن است.

روش MTT اولین بار در سال 1983 توسط Mosmann و همکاران معرفی شد.

Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays

 در سالهای بعدی این روش بهینه تر شده و تغییراتی در آن داده شد تا در نهایت به روشی که امروزه در آزمایشگاه‌ها انجام می‌شود تبدیل شده است. امروزه شرکت‌های مختلفی اقدام به تولید ترکیبات و کیت‌های آماده به استفاده MTT کرده اند که در این کیت‌ها عنصر اصلی یکسان بوده اما تفاوت‌هایی در حلال این کیت‌ها و جزئیات پروتکل انجام شده وجود دارد.برای سهولت در انجام تست MTT و دریافت نتیجه مناسب همچنین صرفه جویی در هزینه‌های آزمایش خود توصیه می‌شود برای انجام تست از کیت MTT شرکت آنا سلول طب استفاده نمایید.

پروتکل MTT:

1- در یک پلیت 96 خانه به مقدار کافی سلول قرار دهید. در هر خانه از پلیت حداکثر حجم نباید از 100 میکرولیتر بالاتر رود.2- به مدت لازم جهت انجام آزمایش انکوبه کنید.3- 10 میکرولیتر از رنگ MTT را به نمونه اضافه کنید تا به میزان غلظت نهایی 0.45 mg/ml دست پیدا کنید.4-به مدت 1 تا 4 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه کنید.5- 100 میکرولیتر از ماده حلال به هر خانه اضافه کرده و میکس کنید.6- در نهایت جذب نمونه را در 570 nm خوانش کنید.

پروتکل MTT برای سنجش اثر سایتوتوکسیک TNF-α بر سلولهای سارکومای موشی:

همانطور که در پروتکل عمومی مشخص است، این پروتوکل تنها کلیت مراحل یک آزمایش MTT را معرفی کرده. برای اینکه با پروتکل اجرای عملی یک تست MTT آشنا شوید تست MTT برای سنجش اثر سایتوتوکسیک TNF-α بر سلولهای سارکومای موشی با جزئیات در ادامه ارائه شده است.

1- سلول سارکومای موشی را در غلظت  10⁶  سلول در میلی لیتر در محیظ کشت همراه با 1 میکروگرم بر میلی لیتر اکنینومایسن برای 3 ساعت انکوبه کنید.

2- سلول‌ها را برداشت کرده و در هر چاهک از پلیت 96 خانه 5 × 10⁴  سلول در 100 میکرولیتر محیط کشت حاوی 1 میکروگرم بر میلی لیتر اکتینومایسین و غلظت‌های مختلف از  TNF-α ( به عنوان مثال 0.001–0.5 ng/ml ) اضافه کنید.

3- سلولهای را به مدت 24 ساعت انکوبه نمایید.

4- بعد از انکوباسیون، 10 میکرولیتر محلول MTT را به هر خانه از پلیت اضافه کنید. در این حالت غلظت نهایی MTT در پلیت شما 0.5 mg/ml خواهد بود.

5- پلیت 96 خانه را به مدت 4 ساعت انکوبه نمایید.

6- در این مرحله 100 میکرولیتر از محلول حل کننده به هر خانه اضافه کنید.

7- در این مرحله بایستی کریستال‌های فرمازان تشکیل شده به درستی حل شوند. برخی از منابع در این مرحله توصیه به پیپتینگ میکنند و برخی قرار دادن بر شیکر اربیتال را پیشنهاد میکنند. اما در یکی از رفرنس‌های معتبر توصیه به قرار دادن پلیت به مدت یک شبانه روز در انکوباتور شده بود.  دقت داشته باشید که هدف نهایی حل شدن کامل کریستالهای فرمازان است که به هر روشی بایستی انجام شود.

8-میزان جذب نوری را با استفاده از دستگاه پلیت ریدر خوانش کنید.

همانطور که مشخص است در نمودار سمیت سنجی، بایستی نموداری کاهشی به شکل بالا مشاهده کنید.

بررسی رشد سلولی توسط روش MTT:

برای بررسی رشد سلولی توسط روش MTT بایستی مشابه روش سایتوتوکسیسیتی عمل کنیم اما با توجه به اینکه انتظار رشد سلول را داریم، سلول اولیه بایستی کمتر از حالت کشندگی باشد.

به عنوان نمونه پروتوکول تاثیر اینترلوکین 6 بر سلولهای هیبریدومای موشی را در ادامه بررسی میکنیم.

1- ابتدا 2 × 10³سلول در یک چاهک پلیت 96 خانه همراه با 100 میکرولیتر محیط کشت حاوی سریال غلظتی اینترلوکین 6 وارد میکنیم. به عنوان مثال 0.1-10 U/ml (0.001-0.1 ng/ml)

2- پلیت کشت سلول را به مدت 4 روز در انکوباتور قرار میدهیم.

3- به هر خانه از پلیت 10 میکرولیتر از معرف MTT اضافه میکنیم. غلظت نهایی MTT بایستی 0.5 میکروگرم در میلی لیتر باشد.

4- به مدت 4 ساعت پلیت حاوی MTT و سلول را انکوبه میکنیم.

4- به میزان 100 میکرولیتر محلول حل کننده به هر چاهک اضافه میکنیم.

5- پلیت را به مدت یک شب در انکوباتور قرار می‌دهیم.

6-میزان جذب نوری را در رنج 550 تا 600 نانومتر با استفاده از دستگاه پلیت ریدر خوانده و نمودار میزان رشد سلول در حضور مقادیر مختلف اینترلوکین 6 را رسم می‌کنیم.

تست xtt چیست:

تست xtt شباهت بسیار زیادی از نظر تکنیک به تست mtt دارد. در این روش به جای رنگ mtt از یک نمک تترازولیوم اصلاح شده به نام xtt استفاده میشود.

تفاوت xtt و mtt :

دو روش mtt و xtt از نظر تئوری و نحوه انجام مشابه هستند اما تفاوت عمده این دو روش در این است که رنگ MTT نامحلول بوده و بعد از انجام تست بایستی کریستال های آن در یک حلال مانند dmso حل شود اما رنگ XTT محلول بوده و در تست XTT نیازی به استفاده از حلال نداریم. این تفاوت باعث میشود که تست XTT سریع تر و با دقت بیشتری نسبت به MTT انجام شود.

تفاوت دو تست mtt و xtt